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蛋白印跡操作流程

日期：2025-06-17 05:10

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摘要：蛋白印跡，也稱Western，Western blot、Westernblotting、Western印跡，簡稱WB，是用**學方法檢測蛋白，研究蛋白質的表達調控的重要方法之一。蛋白印跡可以參考如下步驟進行操作。 1.蛋白樣品的製備(Proteinsamplepreparation) 可以選用適當的裂解液，如細胞裂解液，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對於某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白。為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，收集的蛋白樣品均應測定其蛋白濃度。蛋白濃度的測定...

蛋白印跡，也稱Western，Western blot、Westernblotting、Western印跡，簡稱WB，是用**學方法檢測蛋白，研究蛋白質的表達調控的重要方法之一。蛋白印跡可以參考如下步驟進行操作。
1.蛋白樣品的製備(Proteinsamplepreparation)
可以選用適當的裂解液，如細胞裂解液，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對於某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白。
為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，收集的蛋白樣品均應測定其蛋白濃度。蛋白濃度的測定方法，應根據組織細胞裂解或勻漿所使用的方法及裂解液的不同選用，因為去垢劑和還原劑等對不同蛋白濃度測定方法的影響差彆很大。

2.電泳(Electrophoresis)
(1)SDS-PAGE凝膠配製
SDS-PAGE凝膠可以參考文獻資料進行配製。

(2)樣品處理
  在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液，放置於水漂上於100℃或沸水浴中加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。使用濃縮的蛋白上樣緩衝液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以加入更多的蛋白樣品。蛋白上樣緩衝液可以參考相關文獻資料自行配製。
(3)上樣與電泳
    冷卻到室溫後，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可電泳，電泳緩衝液可以參考相關文獻資料自行配製。為了便於觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預染蛋白質分子量標準。電泳時通常在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對於標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可設置在120V左右。
   采用普通的電泳儀就可以滿足SDS-PAGE電泳的要求。為方便起見，也可整個SDS-PAGE電泳過程均采用恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然後設定時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過衝。
   通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離後即可停止電泳。
    3. 轉膜(Transfer)
   在Western實驗中，我們**選用PVDF膜，也可以使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特彆是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商**的使用步驟。轉膜電泳緩衝液可以參考相關文獻資料自行配製。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。如使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，轉膜電流可設定為300-400m，轉膜時間為30-60分鐘或15-20mA於4℃轉膜過夜。
   在轉膜過程中，特彆是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。轉膜效果可以通過預染蛋白質分子量標準觀察轉膜效果，通常分子量大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍染色液對轉膜後的PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
    4. 封閉(Blocking)
   轉膜完畢後，立即把蛋白膜放置到預先準備好的WB洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢起，以後所有的步驟均要注意膜的保濕，避免膜的乾燥，否則*易產生較高的背景。為減少液體使用量，避免乾膜，您可以選用賽馳生物提供的雜交袋進行後續操作，可用巴斯特吸管吸儘洗滌液，加入WB封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。如背景較高，可以在4℃封閉過夜。在整個Western過程中可使用側擺搖床，側向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
   5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)
   參考一抗的說明書，按比例用WB一抗稀釋液適當稀釋一抗。用巴斯特吸管吸儘封閉液，不要漂洗，直接加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果效果不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜。回收一抗，加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸儘洗滌液後，再加入洗滌液，漂洗3-5次，每次5-10分鐘。如果結果背景較高可以適當延長漂洗時間並增加漂洗次數。
   6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)
   參考二抗的說明書，按照適當比例用WB二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。用巴斯特吸管吸儘洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。回收二抗，加入WB洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸儘洗滌液後，再加入洗滌液，漂洗3-5次，每次5-10分鐘。如果顯色結果背景較高，可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。
    7. 蛋白檢測(Detectionofproteins)
    檢測結果可使用DAB染色試劑或氯萘酚染色試劑來檢測蛋白。
    8.膜的重複利用(Membranerecovery)
   如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用WB抗體去除液處理蛋白膜，以重複利用蛋白膜。

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