常用包埋劑選擇指南

常用包埋劑選擇指南   

    我們在實驗中需要各種各樣的包埋劑：石蠟、樹脂等等，哪種適合自己呢？剛開始進入實驗室的同學會有些茫然，這裡我向大家推薦一些包埋劑的選擇方法。

   我們就從簡單的說起，根據自己的研究目標物需要切多厚的片子和自己實驗室的常規設備來決定用電鏡還是光鏡解決問題。切記，光鏡即可判定的問題就用光鏡，快速且容易掌握，利於問題的解決，何樂而不為呢，節約時間和錢，這才是主要的。光鏡常用什麼包埋劑呢，石蠟！石蠟到處都有售賣，經濟又實惠，普通的切片完全滿足的了。但是如果石蠟解決不了我的問題，我需要更精準的研究，或者我的樣本根本不能用石蠟包埋，我需要低溫，我需要染色，我需要電鏡觀察，這怎麼辦呢？

    樣本包埋的目的是什麼，這是我們思考問題的基本出發點。樣本製備過程中的滲透和包埋的目的是使包埋劑逐步滲透入組織細胞內，以便與細胞外的包埋劑同時聚合，保證能切出質量好的超薄切片。光學顯微鏡觀察的切片一般是用石蠟包埋的，但電子顯微鏡觀察的切片比石蠟切片要薄得多，因此，石蠟不適宜做超薄切片。一般電鏡用的包埋劑應具備如下的特點：

硬度適宜而且均一,有良好的切割性能，目前通用的包埋劑切割性能都很好。一般來說，Epon 812和非極性丙烯酸樹脂的切割性能要比低粘度的環氧樹脂（如Spurr等）以及極性丙烯酸樹脂（如Lowicryl K4M等）好。

能溶於脫水劑或滲透的過渡試劑，並且有足夠的低粘度，以保證能自由地滲入樣品

對樣品的傷害不大，聚合前後體積變化不大，環氧樹脂聚合前後體積變化不大，而丙烯酸樹脂收縮相對大一些（體積收縮15-20%）。

能經受電子束轟擊

透明度好，高倍電鏡下不顯示本身任何微細結構

毒性低，使用方便，但目前使用的包埋劑在聚合之前都有毒，操作時要注意。

    根據上述對包埋劑的要求，目前在電鏡技術上使用的包埋劑種類頗多，但普遍使用的是環氧樹脂，在**和細胞化學技術中普遍使用的則是丙烯酸樹脂。

    環氧樹脂的型號較多，常用Epon812，Spurr樹脂（ERL-4221）等。環氧樹脂包埋劑對細胞微細結構有較好的保存性能，聚合後體積縮小較少，而且在真空中能經受較長時間的轟擊。但它的操作不太方便，反差較弱。

    丙烯酸樹脂無色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸單體粘度低，可以在低溫下滲透及聚合，因而能滿足**和細胞化學技術低溫操作的要求。其聚合方式有兩種，熱聚合和紫外線照射聚合。但它對脂類等成分的抽提比環氧樹脂嚴重，為此它也需要在較低的溫度下使用才可能減少抽提作用。此外，聚合前後丙烯酸樹脂的體積變化較環氧樹脂大（體積大約收縮10-20%），並且它在電子束的照射下穩定性比環氧樹脂低，放熱的聚合過程可引起組織細胞結構的損傷，致敏性也比環氧樹脂強，使用時要小心防護。一般來說，除了**和細胞化學技術外，超微結構的研究並不推薦使用它。在電鏡中使用較多的丙烯酸樹脂有倫敦白膠（LR White）和Lowicryl係列的樹脂以及technovit係列樹脂。

1.冰凍切片包埋劑

    常規石蠟包埋切片，樣本需要作一係列技術處理，一般需化費24小時方可完成全部製片過程。醫院有時需要快速切片診斷，快速冰凍切片是目前常用的方法，其中就用到了冰凍切片包埋劑。冰凍切片包埋劑常見的是OCT冰凍切片包埋劑和TBS冰凍切片包埋劑。對於需要完整包埋較大組織的研究人員來說，TBS包埋劑可能得到更好的切片質量。

2.Epon812（Embed 812）包埋劑 

    Epon812（Embed 812）是一種進口樹脂，它是一種長鏈的脂肪族環氧化合物，是目前國際上普遍采用的一種好包埋劑，常態粘度為150-210cP。該包埋劑的配製方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方進行。下述配方若改變A液和B液的比例則可調節聚合塊硬度，A液多則軟，B液多則硬。A:B=1:1的配方適用普通的應用。通常冬天使用A:B=2:8；夏天使用A:B=1:9，可視組織的硬度和氣候不同選擇其比例。配製時可先分彆配製A液和B液，然後將A液和B液按一定比例混合後，再加入1%-2%的加速劑（BDMA需要 2.5-3%，如用 DMP-30僅需 1.5-2%），邊加邊攪拌，使其充分混合。

    有人將EMbed 812，DDSA，MNA三種成分按一定比例直接混合使用。根據樣品塊的硬度推薦不同的配方，這些知識產品的說明書裡麵就有。你常見到“根據南方地區的氣候條件，可用下列配方”字樣，這說明812樹脂包埋時受到環境濕度和溫度的影響較大，這會給我們的實驗會帶來一些不確定的因素，習慣選擇812樹脂做包埋的的一般是些實驗老手，經驗豐富，掌控力強，新手要多加小心。

3.Spurr（ERL-4221包埋劑）包埋劑

    這是1969年由Spurr推薦使用的包埋劑，所以也稱Spurr樹脂。它含有兩個環氧基，是一種低粘度（7-10cP）的環氧樹脂。由於具有粘度低的特點，所以近年來一些實驗室已開始使用它。其配方可按表中各種成分的比例，即可獲得不同性能的包埋塊。

    Spurr樹脂硬度可用DER-736的量來調節。配製時，先把前三種成分混合後，後才加入DMAE，但從開始到混合完成，達到淡黃色狀態需3-7天。此包埋劑在70C，一般8小時即可完全聚合，用陳舊的包埋劑時，則聚合時間會減少。因Spurr樹脂嗜氧，聚合時不要加蓋。包埋劑用新鮮配製，但為了方便，可預先配製好保存在低溫和防潮的環境中。Spurr樹脂與Embed812樹脂相比粘度低，操作方便，新手容易掌握一點，但毒性比Embed 812樹脂大，所以操作時要更加小心。

4.倫敦白膠（LR White） 

    倫敦白膠含有7種不同的丙烯酸單體和2種增塑劑，引發劑是BPO（dibenzoyl peroxide），其具體的配方和成分冇有報道。它的粘度低，滲透能力強，可用於較大的組織塊或致密的組織，由於它有一定的親水性，方便水性染料進入，染色效果佳，使用非常方便。倫敦白膠可以微溶於水，因而可以采用部分脫水方案，但不能使用丙酮作為脫水劑。氧氣會抑製聚合反應的進行，因而聚合時要在模塊中注滿包埋劑並蓋緊蓋子。此外，倫敦白膠不能在-15C以下的溫度使用。為了方便運輸和儲存，通常出售未加BPO的中等硬度的倫敦白膠（uncatalysed LR White），這種試劑買回需要自己加入催化劑（9.9g催化劑/500gLR White）充分攪拌並室溫放置24小時以上才能使用。充分混合的包埋劑同樣保存在4C中，一旦加入催化劑後，它的有效期便為12個月。

5.Lowicryl係列包埋劑 

    Lowicryl係列包埋劑是專為低溫（-20C以下）包埋設計的包埋劑。它有兩種類型：一種是極性樹脂，K4M（低滲透溫度為-30C，低聚合溫度為-50C}）和K11M（低滲透溫度為-60C，低聚合溫度為-60C）；另一種是非極性樹脂，HM20（低滲透溫度為-50C，低聚合溫度為-50C和HM23（低滲透溫度為-80C}，低聚合溫度為-80C}）。極性樹脂親水，使樣品保存在一個水性的環境中從而較少蛋白質變性，且染色的效果較好。而非極性樹脂的切割性能比較好。兩種樹脂通常都在隔絕氧氣的情況下低溫紫外線照射聚合。Lowicryl係列包埋劑全部以試劑盒的形式出售，有詳細的說明書提供參考。

6.滲透和包埋的注意事項

包埋過程中，一切器材用品都要乾淨、乾燥 

配製包埋劑時，每加一種試劑都要充分攪拌均勻，並儘量防止產生氣泡 

若用Epon包埋，還要控製室內的濕度（相對濕度在60%左右），否則聚合不均勻，造成切片困難，甚至包埋完全失敗

包埋塊要保存在乾燥器內，以防吸濕 

7.怎樣從得到的圖像來指導包埋劑選擇

滲透和包埋引起的圖象缺陷主要由不合適的包埋劑配方引起。不合適的包埋劑配方能產生細胞器皺縮、切片擠壓等缺陷。環氧樹脂的聚合一般需要一種次級的非環氧化分子（硬化劑）。硬化劑和樹脂的環氧基反應形成鍵，使單體結合在一起。樹脂的環氧基和硬化劑的反應基之間的比率決定了聚合鏈的長度，也決定了樹脂塊的切割性能。雖然切片的擠壓、顫痕和表麵缺陷常受到超薄切片刀的質量的影響。但優化樹脂的配方，選擇合適的比例可以降低這種缺陷的形成。

一般來說，在選擇包埋劑配方時，應選擇與樣品的軟硬度相當的配方。組織或組織成分的腫脹也可能是包埋劑配方不當引起的缺陷。如：當切片從包埋塊中切下後浮於水表麵時，含有組織成分的部分切片可能腫脹甚至在水麵擴散開來。這種情況的出現，是樹脂不均勻地滲透組織，特彆是樹脂各組分的分離，導致了聚合不完全的樹脂微池。這樣，組織、細胞和細胞器等基於它們被滲透的情況，可能以不同的速率發生腫脹（或收縮），從而導致切片變形甚至解體。