常見組織細胞的培養方法

體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由於物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差彆，所采取的培養技術措施亦不儘相同，現介紹個彆組織細胞培養的要點如下:

一節 上皮細胞培養

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由於癌起源於上皮組織，故上皮細胞培養特彆受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往*過上皮細胞，並難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。

體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利於生長，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線照射後）時，細胞易生長並可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利於表皮細胞生長。

以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳誌夫 1981）

1、取材：外科植皮或手術殘餘皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊後，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

6、反複吹打，製成懸液。

7、培養：用80目不鏽鋼紗網濾過後，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）製成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。

二節 內皮細胞培養

內皮細胞易於從大血管分離培養成單層細胞，對於研究內皮****、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法為簡便，其法如下：

1、產後新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養，可於12小時內保存於4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩紮緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗製膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩紮，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，於離心管中，注入溫PBS輕輕反複衝洗後，一並注入離心管中（此步驟可重複）。
5、離心去上清，加入RPMI1640培養液製成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

三節 神經細胞培養

神經細胞（神經元）不易培養，隻有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

人、鼠等腦組織即可用於神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞係。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

一． 設備： 無菌操作設備。

二． 大型設備CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

倒置顯微鏡：用於每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡，用於準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用於保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用於儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱乾烤箱：用於**玻璃器皿。

高壓**鍋：用於**培養皿，手術器械。

過濾器：配製解剖液、培養液，必須過濾後才可使用，以去除**。

滲透壓儀，pH劑，天平等。

三． 培養器皿及手術器械

1 培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2 培養板，24-40孔，可用於開放培養。

3 培養瓶：

4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、**後方可使用。

5 各類培養液貯存器。

6 小型手術器械。

準備：

一 配製培養液

（1） 解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配製成PBS緩衝液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2） 基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3） 接種培養液：用於胰酶消化後的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%穀氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配製。

（4）維持培養液：接種後24h，全部換成此液，後每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%穀氨酰胺，及適量的支持性營養物質。

二 培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再塗膠

三**培養皿的備用。所有培養器皿均需清水衝洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置於烤箱中乾燥**，於培養前1天進行。

神經細胞分散培養

（一）選材常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。

（二） 取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定於瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分彆培養。

（三）細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，並洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉澱後吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種於培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

（四） 抑製膠質細胞生長。培養3-5d後，也有人認為培養7d後，用阿糖胞苷，或5-FU抑製神經膠質細胞的生長。

（五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，並有集合現象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片於神經細胞下麵，形成地毯，2周時神經細胞生長豐滿，四周暈光明顯，一個月後，有些神經細胞開始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周適宜。

但神經細胞隻能增大，而不能增殖，隻能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養時間的延長，細胞數量在下降，但膠質細胞可以，神經膠質細胞也可以。在培養過程中，早期9-12d時，有較多的神經細胞死亡，這是一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之後存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。

（六） 常用培養細胞實驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；**組化分析；

但**組化分析應注意，由於抗體直接作用於活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在**組化中，或其它組織學染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯；GFAP對星形膠質細胞具有特異性染色等。這對研究神經係統中膠質細胞功能具有*大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視，其在腦血管**（如缺血性損傷）、退行性**（如AD、PD）、損傷後膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。

四節 肌組織細胞培養

各種肌組織均可用於培養，以心肌和骨骼肌較實用。

（－）骨骼肌細胞培養

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊後，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過。

3、計數調整細胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養基培養。

5、培養基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。

接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。
該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養50－52小時後出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日後融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合後二、三天內能見到收縮現象。

（二）心肌細胞培養

心肌細胞是早的培養材料，Carrel曾長期培養過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養物，常用的是雞胚心肌。

心肌比較容易培養和生長，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時，一周後可見節律性收縮現象。

五節 巨噬細胞培養

巨噬細胞屬**細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞**和分子**學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便於培養，並可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞係，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易於傳代和瓶壁分離，但難以建株。

培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動物於解剖台，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁並微傾向一側．使腹腔中液體集中於針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘後，去上清，加10ml Eagle培養基。

9、計數細胞。每隻鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時後，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液衝洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。

六節 腎小球分離、移植培養

SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置*淨台內，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無菌培養皿洗滌，置80目不鏽鋼篩網上。用扁平自製小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網，濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不鏽鋼篩網，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不鏽鋼篩網，輕輕濾過，Hank's液洗滌1次，收集網上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。

腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數後接種至24孔培養板或25ml培養瓶，使腎小球大於60個/cm2，加培養基5～10ml（培養基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的鬆；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養8～10天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續培養24小時，形態學觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約100μm。

七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自製裝置（分彆作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。

常規方法接種培養收獲細胞。