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**组化操作流程

日期：2024-05-08 02:25

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摘要：（一）、仪器设备 1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴箱（二）、试剂 1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4） 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml 3．0.5mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0） 4. 1mol/L的TBS缓冲液（pH 8.0） 5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶 b.0.4%胃蛋白酶液 6. 3%甲醇―H2O2溶液 7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制 8．TBS/PBS pH 9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本; pH 7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、...

（一）、仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴箱

（二）、试剂
1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）
4. 1mol/L的TBS缓冲液（pH 8.0）

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶 b.0.4%胃蛋白酶液
6. 3%甲醇―H₂O₂溶液
7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS pH 9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本; pH 7.0-7.4适合光学纤维标本
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化

脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：
A 抗原热修复
a 高压热修复在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01mmol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。b沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原：Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法

在抗原酶消化修复中，常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
3、**组化染色SP法
（1）脱蜡、水化
（2）PBS洗2-3次各5分钟
（3）3% H₂O₂(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟
（4）PBS洗2-3次各5分钟
（5）抗原修复
（6）PBS洗2-3次各5分钟
（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟
（10）PBS洗3次每次2分钟
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时
（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.
（13）PBS洗3次各5分钟
（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度
（15）PBS或自来水冲洗10分钟
（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化
（17）自来水冲洗10-15分钟
（18）脱水、透明、封片、镜检。
4、SABC法
（1）脱蜡、水化
（2）PBS洗2次各5分钟
（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H₂O₂，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
（12） PBS洗4次各5分钟
（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。

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