常用包埋剂选择指南

常用包埋剂选择指南   

    我们在实验中需要各种各样的包埋剂：石蜡、树脂等等，哪种适合自己呢？刚开始进入实验室的同学会有些茫然，这里我向大家**一些包埋剂的选择方法。

   我们就从简单的说起，根据自己的研究目标物需要切多厚的片子和自己实验室的常规设备来决定用电镜还是光镜解决问题。切记，光镜即可判定的问题就用光镜，快速且容易掌握，利于问题的解决，何乐而不为呢，节约时间和钱，这才是主要的。光镜常用什么包埋剂呢，石蜡！石蜡到处都有售卖，经济又实惠，普通的切片完全满足的了。但是如果石蜡解决不了我的问题，我需要更精准的研究，或者我的样本根本不能用石蜡包埋，我需要低温，我需要染色，我需要电镜观察，这怎么办呢？

    样本包埋的目的是什么，这是我们思考问题的基本出发点。样本制备过程中的渗透和包埋的目的是使包埋剂逐步渗透入组织细胞内，以便与细胞外的包埋剂同时聚合，保证能切出质量好的*薄切片。光学显微镜观察的切片一般是用石蜡包埋的，但电子显微镜观察的切片比石蜡切片要薄得多，因此，石蜡不适宜做*薄切片。一般电镜用的包埋剂应具备如下的特点：

硬度适宜而且均一,有良好的切割性能，目前通用的包埋剂切割性能都很好。一般来说，Epon 812和非*性丙烯酸树脂的切割性能要比低粘度的环氧树脂（如Spurr等）以及*性丙烯酸树脂（如Lowicryl K4M等）好。

能溶于脱水剂或渗透的过渡试剂，并且有足够的低粘度，以保证能自由地渗入样品

对样品的伤害不大，聚合前后体积变化不大，环氧树脂聚合前后体积变化不大，而丙烯酸树脂收缩相对大一些（体积收缩15-20%）。

能经受电子束轰击

透明度好，高倍电镜下不显示本身任何微细结构

毒性低，使用方便，但目前使用的包埋剂在聚合之前都有毒，操作时要注意。

    根据上述对包埋剂的要求，目前在电镜技术上使用的包埋剂种类颇多，但普遍使用的是环氧树脂，在**和细胞化学技术中普遍使用的则是丙烯酸树脂。

    环氧树脂的型号较多，常用Epon812，Spurr树脂（ERL-4221）等。环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能，聚合后体积缩小较少，而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它的操作不太方便，反差较弱。

    丙烯酸树脂无色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸单体粘度低，可以在低温下渗透及聚合，因而能满足**和细胞化学技术低温操作的要求。其聚合方式有两种，热聚合和紫外线照射聚合。但它对脂类等成分的抽提比环氧树脂严重，为此它也需要在较低的温度下使用才可能减少抽提作用。此外，聚合前后丙烯酸树脂的体积变化较环氧树脂大（体积大约收缩10-20%），并且它在电子束的照射下稳定性比环氧树脂低，放热的聚合过程可引起组织细胞结构的损伤，致敏性也比环氧树脂强，使用时要小心防护。一般来说，除了**和细胞化学技术外，*微结构的研究并不**使用它。在电镜中使用较多的丙烯酸树脂有伦敦白胶（LR White）和Lowicryl系列的树脂以及technovit系列树脂。

1.冰冻切片包埋剂

    常规石蜡包埋切片，样本需要作一系列技术处理，一般需化费24小时方可完成全部制片过程。医院有时需要快速切片诊断，快速冰冻切片是目前常用的方法，其中就用到了冰冻切片包埋剂。冰冻切片包埋剂常见的是OCT冰冻切片包埋剂和TBS冰冻切片包埋剂。对于需要完整包埋较大组织的研究人员来说，TBS包埋剂可能得到更好的切片质量。

2.Epon812（Embed 812）包埋剂 

    Epon812（Embed 812）是一种进口树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，是目前国际上普遍采用的一种好包埋剂，常态粘度为150-210cP。该包埋剂的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方进行。下述配方若改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，A液多则软，B液多则硬。A:B=1:1的配方适用普通的应用。通常冬天使用A:B=2:8；夏天使用A:B=1:9，可视组织的硬度和气候不同选择其比例。配制时可先分别配制A液和B液，然后将A液和B液按一定比例混合后，再加入1%-2%的加速剂（BDMA需要 2.5-3%，如用 DMP-30仅需 1.5-2%），边加边搅拌，使其充分混合。

    有人将EMbed 812，DDSA，MNA三种成分按一定比例直接混合使用。根据样品块的硬度**不同的配方，这些知识产品的说明书里面就有。你常见到“根据南方地区的气候条件，可用下列配方”字样，这说明812树脂包埋时受到环境湿度和温度的影响较大，这会给我们的实验会带来一些不确定的因素，习惯选择812树脂做包埋的的一般是些实验老手，经验丰富，掌控力强，新手要多加小心。

3.Spurr（ERL-4221包埋剂）包埋剂

    这是1969年由Spurr**使用的包埋剂，所以也称Spurr树脂。它含有两个环氧基，是一种低粘度（7-10cP）的环氧树脂。由于具有粘度低的特点，所以近年来一些实验室已开始使用它。其配方可按表中各种成分的比例，即可获得不同性能的包埋块。

    Spurr树脂硬度可用DER-736的量来调节。配制时，先把前三种成分混合后，后才加入DMAE，但从开始到混合完成，达到淡黄色状态需3-7天。此包埋剂在70C，一般8小时即可完全聚合，用陈旧的包埋剂时，则聚合时间会减少。因Spurr树脂嗜氧，聚合时不要加盖。包埋剂用新鲜配制，但为了方便，可预先配制好保存在低温和防潮的环境中。Spurr树脂与Embed812树脂相比粘度低，操作方便，新手容易掌握一点，但毒性比Embed 812树脂大，所以操作时要更加小心。

4.伦敦白胶（LR White） 

    伦敦白胶含有7种不同的丙烯酸单体和2种增塑剂，引发剂是BPO（dibenzoyl peroxide），其具体的配方和成分没有报道。它的粘度低，渗透能力强，可用于较大的组织块或致密的组织，由于它有一定的亲水性，方便水性染料进入，染色效果佳，使用非常方便。伦敦白胶可以微溶于水，因而可以采用部分脱水方案，但不能使用丙酮作为脱水剂。氧气会抑制聚合反应的进行，因而聚合时要在模块中注满包埋剂并盖紧盖子。此外，伦敦白胶不能在-15C以下的温度使用。为了方便运输和储存，通常出售未加BPO的中等硬度的伦敦白胶（uncatalysed LR White），这种试剂买回需要自己加入催化剂（9.9g催化剂/500gLR White）充分搅拌并室温放置24小时以上才能使用。充分混合的包埋剂同样保存在4C中，一旦加入催化剂后，它的有效期便为12个月。

5.Lowicryl系列包埋剂 

    Lowicryl系列包埋剂是专为低温（-20C以下）包埋设计的包埋剂。它有两种类型：一种是*性树脂，K4M（低渗透温度为-30C，低聚合温度为-50C}）和K11M（低渗透温度为-60C，低聚合温度为-60C）；另一种是非*性树脂，HM20（低渗透温度为-50C，低聚合温度为-50C和HM23（低渗透温度为-80C}，低聚合温度为-80C}）。*性树脂亲水，使样品保存在一个水性的环境中从而较少蛋白质变性，且染色的效果较好。而非*性树脂的切割性能比较好。两种树脂通常都在隔绝氧气的情况下低温紫外线照射聚合。Lowicryl系列包埋剂全部以试剂盒的形式出售，有详细的说明书提供参考。

6.渗透和包埋的注意事项

包埋过程中，一切器材用品都要干净、干燥 

配制包埋剂时，每加一种试剂都要充分搅拌均匀，并尽量防止产生气泡 

若用Epon包埋，还要控制室内的湿度（相对湿度在60%左右），否则聚合不均匀，造成切片困难，甚至包埋完全失败

包埋块要保存在干燥器内，以防吸湿 

7.怎样从得到的图像来指导包埋剂选择

渗透和包埋引起的图象缺陷主要由不合适的包埋剂配方引起。不合适的包埋剂配方能产生细胞器皱缩、切片挤压等缺陷。环氧树脂的聚合一般需要一种次级的非环氧化分子（硬化剂）。硬化剂和树脂的环氧基反应形成键，使单体结合在一起。树脂的环氧基和硬化剂的反应基之间的比率决定了聚合链的长度，也决定了树脂块的切割性能。虽然切片的挤压、颤痕和表面缺陷常受到*薄切片刀的质量的影响。但优化树脂的配方，选择合适的比例可以降低这种缺陷的形成。

一般来说，在选择包埋剂配方时，应选择与样品的软硬度相当的配方。组织或组织成分的肿胀也可能是包埋剂配方不当引起的缺陷。如：当切片从包埋块中切下后浮于水表面时，含有组织成分的部分切片可能肿胀甚至在水面扩散开来。这种情况的出现，是树脂不均匀地渗透组织，特别是树脂各组分的分离，导致了聚合不完全的树脂微池。这样，组织、细胞和细胞器等基于它们被渗透的情况，可能以不同的速率发生肿胀（或收缩），从而导致切片变形甚至解体。